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顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和SDS等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
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